干货| 你的荧光定量PCR做好了吗？

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1.什么是荧光定量PCR

2020年一场突如其来的疫情打乱了各位小伙伴的安排，在这次疫情中有一种检测方法被用作临床诊断的金标准，它就是核酸检测。核酸检测的主要方法是利用荧光定量PCR来确定样品中是否含有某一特定病原物。

作为疾病检测的重要手段之一，荧光定量PCR是如何工作的呢？不同于常规PCR，它在反应体系中加入荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始含量。

2.进行荧光定量PCR的方法

设计qPCR实验的关键一步是选择监测目标序列扩增的化学方法，可用的方法多种多样，主要分为两大类，第一类是DNA结合染料（SYBR Green I），第二类是荧光染料标记的序列特异性寡聚核苷酸探针（Taqman、分子信标和Eclipse等）。实时荧光PCR最常用的化学方法是DNA结合染料SYBR Green I和Taqman 水解探针。下面让我们来了解一下这些方法：

SYBR Green I染料法

原理：SYBR Green I是荧光定量PCR最常见的DNA结合染料，它与双链DNA（dsDNA）非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与dsDNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的dsDNA量成正比，且会随扩增产物的增加而增加。

优点：实验设计简单，无需设计探针，成本低。

缺点：特异性不高，即DNA结合染料可以结合任一dsDNA。因此，荧光定量反应中非特异性产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性。需要做熔解曲线分析。

除了染料法外，我们还可以选择探针法。基于荧光标记探针的化学方法总体特异性均要比染料法强不少。这些化学方法利用荧光共振能量转移（FRET）或一些其他淬灭形式，保证仅在出现特异性扩增产物时荧光才能被监测到。

Taqman探针法

原理：Taqman实验使用一条序列特异性、荧光标记的寡聚核苷酸探针(Taqman探针)和一对序列特异性的引物。基于引物和探针的双重特异性，特异性非常高。

Taqman工作的原理与所知的5’-核酸酶实验一样，利用某些热稳定性聚合酶的5’-核酸外切酶活性，如Taq，探针包含5’端的荧光报告基团和3’端的荧光淬灭基团。当探针完整时，由于接近淬灭基团，报告基团的荧光被淬灭，无法检测到荧光。在扩增反应退火/延伸合并的阶段，探针与靶标杂交，Taq对dsDNA特异的5’→3’外切酶活性切除报告基团，导致报告基团与淬灭基团分离，荧光被检测到，产生的荧光信号与扩增产物量成正比。

对于不同的扩增产物使用不同光谱性质的荧光基团可以实现在单孔中同时进行多个扩增产物的检测，即多重荧光定量PCR。常用的荧光报告基团为荧光素（FAM,发出绿色荧光），淬灭基团为BHQ1。

优点：高特异性、高信噪比、高灵敏度、能进行多重反应。

缺点：探针的初始成本高、实验设计繁琐。

除了Taqman荧光定量探针法之外，擎小科再给大家介绍一种新的探针---分子信标。

分子信标法

原理：分子信标法同样需要一对特异性引物和一个荧光标记的寡聚核苷酸探针，其特殊的地方是，探针能形成茎环状发夹结构。分子信标的5’端附有荧光报告基团，3’端附有淬灭基团，环被设计成与靶标序列的15-30核苷酸特异杂交，环的两端各有5-6核苷酸互补成茎结构，将报告基团与淬灭基团连接到一起。发夹结构中，由于报告基团接近淬灭基团，监测不到荧光信号，在扩增反应的退火阶段，分子信标与靶序列结合，报告基团与淬灭基团分离，报告基团荧光被检测到。

与Taqman实验不同，在反应中分子信标被替代而不是被破坏，因此所用的DNA聚合酶缺乏5’核酸外切酶的活性。由分子信标上报告基团发出的荧光信号强度与反应中靶标的量成正比。

分子信标在热动力学上更加青睐发夹结构，而不是非特异性靶标序列，因此探针具有高度特异性。完美匹配的探针-靶序列杂交体在能量上比茎环结构更稳定，而错配的探针-靶序列杂交体在能量上不如茎环结构稳定。

优点：高特性性，可以用于多重反应，如果靶标序列与信标匹配不正确，导致无法杂交而不能发出荧光。

缺点：使用分子信标的最大缺点是它的设计，发夹的茎必须坚固以防止分子的随机折叠成非发夹结构，非发夹结构会导致随意荧光产生。同时，发夹的茎不要太坚固，否则信标不能与靶标正确杂交。

3.荧光定量PCR相关概念

荧光定量常见的一些概念：扩增曲线，熔解曲线，标准曲线、基线，荧光阈值，CT值等都是怎么回事呢？现在擎小科带大家一起来了解一下。

扩增曲线显示两个阶段，指数增长阶段和之后出现的非指数平台阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而，随着反应的进行，反应体系组分的消耗，其中的一种或多种成分限制反应。此时，产物增长速度变慢，反应进入平台期。

基线：指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。

荧光阈值：一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值是PCR 3-15个循环荧光信号标准差的10倍，荧光阈值设定在PCR扩增的指数期，通常由仪器默认生成。

Ct值：表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

熔解曲线：指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。全部DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度(Tm)。目的是为了验证扩增产物特异性。

实时荧光定量表示的是模板浓度与Ct值的关系，因此荧光定量PCR的优化就显得非常重要。优化的qPCR结果通常有以下特点：

线性的标准曲线（R²>0.980）

高扩增效率90-110%

反应复孔重复性好

怎么获取这些数据呢？

举个例子，我们将cDNA或质粒模板按10倍梯度进行稀释（稀释的倍数一定要准确哦，通常模板每稀释10倍，Ct相差3.32），使用擎科2xT5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)得到如下图所示的扩增曲线。以模板稀释倍数的Log值为横坐标，对应Ct值为纵坐标作标准曲线。(说是“曲线”，其实我们得到的是一条直直的线，是直线才能用一次方程来算)

这条线有一个回归系数（即R²），这个值越接近于1，计算出的结果越精确。而扩增效率E=10^-1/斜率-1，带入斜率k值-3.439，E 等于95%。