实验技术 | 实时荧光定量PCR
1、什么是实时荧光定量PCR (RT-PCR，qPCR)？
实时荧光定量PCR反应指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测（即实时），一般简写为（qPCR）。实时定量PCR与终点PCR（Endpoint PCR）的区别在于数据可在PCR扩增过程中进行收集。在实时荧光定量PCR中，反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征，目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加（扩增曲线越靠近的X值越低）。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。
2、如何实现实时检测？
2.1. 1 TaqMan检测：
TaqMan方法是通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。
2.1. 2 使用TaqMan方法的检测类
2.1. 3 TaqMan试剂
最初，使用嵌入式染料进行实时荧光PCR (qPCR) 产物定量。但这些染料存在重大缺点，即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。后通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。
2.1. 4 TaqMan序列检测方法的工作原理
通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。
2.1. 5 TaqMan序列检测方法步骤
2.1. 6 TaqMan 探针的类型
TaqMan探针（含有Invitrogen TAMRA染料——淬灭染料基团）
Applied Biosystems TaqMan MGB探针（用于等位基因检测）
2.1. 7 TaqMan 方法的优、缺点
用于RNA定量的一步法RT-PCR
用于RNA定量的两步法RT-PCR
DNA/cDNA定量
2.1. 8 SYBRGreen I染料试剂
SYBR Green I染料法采用了，一种可以在PCR循环过程中随着PCR产物的累计而对其进行检测的高度特异性双链DNA结合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂可以检测所有双链DNA，包括非特异性的反应产物。因此这样经过特别优化的反应体系，对于获取准确的结果而言是非常必要的。
2.2. 9 SYBR GreenI染料法的检测类型
2.2. 10 SYBRGreen I染料法的工作原理：
SYBR Green I染料法通过SYBR Green I染料与PCR过程中产生的双链DNA结合，而对聚合酶链反应（PCR）的产物进行检测。工作原理：
2.2. 11 SYBR Green I染料法的优、缺点
它可用于监测任何双链 DNA 序列的扩增。无需探针，降低了检测的设置和运行成本。SYBR Green I染料法的最大缺点在于可能会产生假阳性信号；即，因为SYBR Green I染料可与任何的双链DNA发生结合，因此也会与非特异性的双链DNA序列发生结合。
2.2.12 其他注意事项
采用DNA结合染料的另一原因，是多重染料与单一扩增分子的结合。这可提高扩增产物检测的灵敏度。基于多重染料的结合，将迎来信号量取决于在反应中所产生的双链DNA量的局面。因此，如果扩增效率相同，相较于对较短产物的扩增，对较长产物的扩增将会产生更多的信号。这完全不同于荧光探针，使用荧光探针时，对于每个合成的扩增分子淬灭仅释放一个荧光基团，与其长短并不相关。
3、关于定量检测
3.1什么是定量检测？
定量检测是一种实时的PCR (qPCR) 检测。测量（定量）每轮PCR扩增循环中，检测目标核酸片段的量。目标分子可以为DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要对以下三种定量检测进行讨论：1）DNA/cDNA定量；2）采用一步法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的RNA定量；3）采用两步法RT-PCR的RNA定量
3.2定量分析常见术语
4、绝对与相对定量
绝对定量：当对定量检测的结果进行计算时，可以采用绝对或相对定量。绝对定量检测是根据标准曲线对未知样品进行的定量。示例：绝对定量可根据病毒的拷贝数，监控疾病状态。研究者须知道特定生物学样品中目标RNA分子的准确拷贝数，以对疾病的进展进行监测。绝对定量可通过从所有SDS仪器获取的数据进行，但注意标准品的绝对定量则须首先通过其他方法获取。
相对定量：相对定量用于分析特定样品相对于参照样品（比如，未处理的对照组）某个基因表达量的变化。示例：相对定量可用于检测化合物（药物）引起的基因表达改变。经化学处理样品中的特定目标基因的表达水平可与相对未处理样品中的基因表达水平进行比较。
4.1相对定量的计算方法
相对定量可根据从所有SDS仪器获取的数据而进行。用于相对定量的计算方法有：
标准曲线法
比较CT法
4.2使用哪种方法的确定
所有方法都可产生同等的结果。当在确定使用哪种方法时，需要注意：
在不同的反应管中进行目标分子和内源性对照的扩增时，采用标准曲线法进行分析，所需优化和验证操作最少。
采用比较CT法时，则须进行验证实验，以表明目标分子和内源性对照扩增的效率基本相同。比较CT法的优势在于无需标准曲线，从而可以实现通量提高（因为无需额外的孔用于标准曲线的绘制）；并消除在进行标准曲线绘制时因稀释错误所带来的不利结果。
如需将靶标和内源性对照品在同一管内进行扩增，则须优化并限制引物的浓度以避免对 CT 值产生影响。当在一管中进行双重反应时，可以提高通量并减少移液失误所带来的不利影响。
4.3 常用术语
4.4 用于相对定量的标准曲线法
概述：因采用的是相对于基础样品的表达量，例如校准品，用于相对定量的标准曲线一般都比较容易绘制。对于所有的实验样品，其目标分子的量均是从标准曲线获取，然后除以校准品的目标分子量而确定的。因此，校准品便成为1 X 样品，而所有其他的量则都为以n倍校准品来表示。例如，在研究药物对表达产生的影响时，未处理的对照样品便是合理恰当的校准品。
4.4. 1关键指南
4.4.2 内源性对照
对于内源性对照进行扩增可用于对加入至反应的样品RNA或DNA的量进行标准化。对于基因表达定量，研究者采用过 ß-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、核糖体RNA（rRNA）或其他RNA作为内源性对照。
4.4.3 标准品
由于样品量会除以校准品的量，则标准曲线中的单位便被去除了。因此，对于标准品来说所有需要知道的只是它们的相对稀释比。对于相对定量，任何含有合适目标分子的RNA或DNA储存液都可用作标准品。
4.4.4用于相对定量的比较CT法
计算公式：比较CT法与标准曲线法相似，只是它利用的是算术公式2−ΔΔCT来获取相同的相对定量结果。
4.5 用于绝对定量的标准曲线法
概述：用于绝对定量的标准曲线法与用于相对定量的标准曲线法类似，只是标准品的绝对量必须首先通过其他独立方法获取。
4.51关键指南
4.5.2标准品
标准品的绝对量必须首先通过其他独立的方法获取。质粒 DNA 和体外转录的 RNA 通常用于制备绝对标准品。浓度可在A260 处被测量得到，并通过使用DNA或RNA的分子量转化成拷贝数。
4.5.2 standards
The absolute quantity of the standard substance must first be obtained by other independent methods. Plasmid DNA and RNA transcribed in vitro are usually used to prepare absolute standards. The concentration can be measured at a260 and converted to copy number by using the molecular weight of DNA or RNA.
